手把手教你双荧光素酶报告实验

 萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成立刻就生成功能性的萤光素酶，同时在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，检测灵敏度高。荧光素酶报告基因被广泛用于miRNA靶基因验证。

 荧光素酶报告基因的原理在于miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用，可以将目的基因3’UTR区域构建至pGL3-basic载体中报告基因Luciferase的后面，构建荧光素酶质粒。然后转染至细胞中，通过比较过表达或者干扰miRNA后，检测报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用。结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

 同时，为了减少内在的变化因素，比如：培养细胞的数目、细胞转染和裂解的效率等对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录效率的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，首先加入荧光素酶检测试剂Luciferase Assay Reagent II时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶活性。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop&Glo Reagent试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，进行第二次测量，称之为双荧光素酶报告基因实验。

下面就介绍一下萤光素酶实验检测步骤：

一、样品准备：

（1）细胞铺板：将细胞按50%的密度接种到细胞培养12孔板内。

（2）转染：16h左右细胞约70%时转染萤光素酶报告基因质粒，每个样品设置3个复孔。首先设计四组：

空白组（转染试剂+细胞）

质粒组

质粒+miRNA NC组

质粒+miRNA mimics组

2.1配制质粒组：按照每空50ng质粒，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为A。

2.2配制miRNA NC/mimics：miRNA NC/mimics的终浓度为20nM，同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，分别标记为B、C。

2.3配制对应转染试剂：按照每孔0.5μL转染试剂,同时每孔20ul无血清培养基计算需用量，标记为D。

2.3稀释好的四组试剂常温孵育5min。

2.4将稀释好的质粒DNA和miRNA mimics分别和对应转染试剂混匀，常温孵育20min。

2.5将2.4步骤中试剂对应加入孔中。

2.6转染6h后，换新鲜完全培养基。

（1）质粒共转染36-48h后，弃去培养基，用100μL 1XPBS清洗细胞。

（2）倾斜12孔板，吸干剩余的PBS。

（3）去离子水将5XPLB(裂解液)稀释成1XPLB（现配现用），使用前放到常温。

（4）每孔加50μL稀释好的 1X PLB，置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。

（5）选用白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤4的上清液10μL， 加入100μL预先混好的Luciferase Assay Reagent II，2s后测数据，检测荧光素酶反应强度。注意此步需在避光条件下进行。

（6）测定结束后，每孔添加100μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静止2s后，测数据，检测内参海肾荧光素酶反应强度。

（7）记录读数:每个样品会有3个数值：RLU1—萤火虫荧光素酶反应强度, RLU2—内参海肾荧光素酶反应强度,计算两组数据比值，即RLU1/RLU2。

（8）分析数据：比较1、2组可以发现由于对照组未转染质粒，因此检测不到荧光素酶反应强度。比较3、4组，由于转染microRNA mimics进行microRNA的过表达，萤光素酶的活性降低，提示microRNA可能参与抑制靶基因的表达，需要结合定点突变等方法进一步确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。